1. 상세 매뉴얼 구성
◦ 샘플(박테리아 Genomic DNA, Plasmid DNA, 동물 조직, 피, 식물 조직, 곰팡이, 진단용 등)그리고 DNA 추출 목적(PCR, 클로닝, DNA 시퀀싱 등)에 따라 추출 키트 선택.
◦ 인터넷 검색과 과학사를 통해 비교적 쉽게 구입할 수.
◦ DNA 추출 및 정제 DNA preparation (DNA 준비, 줄이기 DNA prep)라는, 미량을 추출하는 경우 DNA mini prep라는.
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◦ 마이크로 피펫과 팁Vortex mixer(믹서), 마이크로 원심 분리기, 미니 원심 분리기, 항온 수조(수욕), 튜브 레크 준비.
◦ 56℃그리고 70℃반응 온도가 필요하기 때문에 추출 시간을 효과적으로 단축하기 위해서는 항온 수조 대신 히팅 블록(히팅 블록)추천.
◦ DNA 추출 및 정제 키트 DNA 흡착(Binding)-세척(워시, 수세)-용출(Elute) 방법은 키트 메이커에 의해 약간의 차이가 있습니다만, 대체 방법은 같습니다.
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◦ 실험 실행 과정에서 약간의 차이가 순도와 농도에 다른 결과를 초래할 수 있기 때문에 순도가 높 DNA얻으려면 반드시 키트 매뉴얼(키트 메이커 프로토콜)미리 숙지하는 것이 좋다.
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◦ 세척용 완충액(Wash buffer)순수한 에탄올(absolute EtOH)시약병에 표시된 눈금까지 추가(추가)하다.
◦ 각 단계 실시 전의 항온 수조(수욕)온도 56℃나 70℃맞추기.
◦ 마이크로 원심 분리기(Microcentrifuge)미니 원심 분리기를 상온에서 사용할 수 있도록 준비하십시오., 필요에 따라 4℃ cooling미리 둡니다.
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◦ 시약을 상온에서 사용할 수 있도록 준비하고,, 세포 용해 완충 용액(Lysis buffer, 그 키트에서 BL과용액) 내 시약이 녹지 않으면 56℃녹는다.
◦ 실험대 준비. 모든 장비를 수평 단단한 바닥에 준비하십시오..
◦ 샘플 준비. 박테리아 Genomic DNA, Plasmid DNA, 동물 조직 Genomic DNA, 피 Genomic DNA, 식물 조직 Genomic DNA, 곰팡이 Genomic DNA, 진단용 DNA 등을 추출하고 싶습니다.
DNA에 따라 키트의 디테일이 다를 수 있으므로 목적에 맞는 키트를 준비한다.
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◦ 이 자료집의 실험 예용 키트는 동물 조직입니다.
Genomic DNA추출에 주로 사용.
◦ 분쇄된(homogenized) 샘플(동물 조직) 20mg 준비
◦ 세포 용해 완충 용액(Lysis buffer, ☞buffer CL) 200μl 추가(추가) – vortexing(vortex mixer을 이용한 혼합)
◦ 단백질 분해 효소(프로테이나 제 K)해결 20μl 추가(추가) – 볼텍스
◦ 투명한 세포 용해액이 될 때까지 56℃ 항온 수조에 넣는다.
◦ 단순히 spin down (미니 원심 분리기에 가볍게 돌려 튜브의 내벽에 용액이 남지 않도록)
◦ 세포 용해 완충 용액(Lysis buffer, ☞buffer BL) 200μl 추가(추가) – 볼텍스 – 70℃ 항온 수조 10분
◦ 순수한 에탄올(absolute EtOH) 200μl 추가(추가) – vortexing(vortex mixer을 이용한 혼합) – spin down(미니 원심 분리기에 가볍게 돌려 튜브 내부 벽면에 액적이 남지 않도록)
◦ 지금까지 준비한 세포 용해 혼합액을 실리카 컬럼에 조심스럽게 올린다.
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◦ 6,000g 이상 1분 동안 원심 분리(미니 원심 분리 가능)
◦ 여과하여 나온 용액을 넣은 케이스(컬렉션 튜브)버리고 컬럼을 새 케이스에 넣습니다.
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◦ 1차 세척
◦ 세척 용액(wash buffer, ☞ buffer BW) 600μl 추가(추가)
◦ 6,000g 이상 1분 동안 원심 분리(미니 원심 분리 가능)
◦ 여과하여 나온 용액을 넣은 케이스(컬렉션 튜브)버리고 컬럼을 새 케이스에 넣습니다.
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◦ 2차 세척
◦ 세척 용액(wash buffer, ☞ buffer TW) 600μl 추가(추가)
◦ 6,000g 이상 1분 동안 원심 분리(미니 원심 분리 가능)
◦ 여과되어 나온 케이스에 속 용액을 따라 버리고 컬럼을 다시 끼운다.
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◦ 13,000g 이상 1분 동안 원심 분리(마이크로 원심 분리기 사용)컬럼 탈수 건조
◦ 컬럼을 멸균된 새로운 마이크로튜브로 옮긴다.
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◦ 용출 용액(wash buffer, ☞ buffer AE) 200μl 추가(추가)
◦ 용출 용액은 증류수로 대체될 수 있다.
◦ 상온에서 1분치해 둔다.
◦ 13,000g 이상 1분 동안 원심 분리(마이크로 원심 분리기 사용)에 의해 용출된 DNA을 튜브에 수집.
◦ 냉장 보관하거나 다음 실험을 진행.